バイオインスパイアされたゼラチンベースの粘着性ハイドロゲルで、熱傷ケアのさまざまな表面に使用可能

Scientific Reports volume 12、記事番号: 13735 (2022) この記事を引用

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適切な熱傷管理では、患者のコンプライアンスが考慮され、創傷閉鎖を促進する環境が提供されます。粘着性のハイドロゲルは創傷管理に役立ちます。これらは、制御された薬物送達と多様な表面付着性を備えた予防感染パッチとして機能します。仮説に基づいた研究により、ポリビニルアルコールとデンプンがヒドロゲル骨格として機能するゼラチンベースのヒドロゲル (GbH) における生物由来のポリドーパミン特性が調査されています。 GbH は、O-H 基が豊富な表面を持つ有望な物理的特性を示しました。 GbH は、乾燥した表面 (ガラス、プラスチック、アルミニウム) や濡れた表面 (豚肉や鶏肉) に粘着性がありました。 GbH は経皮製剤の数学的動態を実証し、試験モデルにおける GbH の in vitro および in vivo 毒性により、モデルの健全な成長と生体適合性が確認されました。ケルセチンを負荷した GbH は、ラットモデルの第 2 度熱傷に対して 4 日目に 45 ～ 50% の創傷収縮を示し、これはスルファジアジン銀治療グループと同等でした。引張強度、生化学物質、結合組織マーカーおよびNF-κBの推定値は、皮膚の正常レベルを模倣するために、GbH治療された治癒創傷において21日目に回復した。生体からインスピレーションを得た GbH は、ラットモデルにおける 2 度熱傷の効率的な創傷治癒を促進し、その前臨床応用可能性を示しています。

人類は自然からのインスピレーションを求めて、新規で機能的なハイドロゲルの作成に成功しました1。ナメクジベースの保護粘液の生体模倣は、アルギン酸塩とポリアクリルアミドを組み合わせた、丈夫で表面に粘着するヒドロゲルの開発に貢献しました 2,3。ドーパミンが水中接着の主成分として作用する、ムール貝などの水生動物にヒントを得た、表面接着ヒドロゲル設計における効果的なドーパミン複合体が最近開発されました4。生物からインスピレーションを得たヒドロゲルの多くは、分子構造から巨視的形状に至るまで、生物系の多様な機能を理解するためのモデルとして生物系を使用して設計されています5。ヒドロゲルは、親水性ポリマー鎖の複雑な三次元 (3-D) ネットワークであり、その親水性を考慮すると、大量の水を含んでいます 6,7。特に人体の主成分は水であり、ヒドロゲルは大量の水を含む可能性があるため、水にさらされると膨潤を示します。したがって、組織工学、薬物送達、自己修復材料、バイオセンサー、止血包帯など、さまざまな生物医学用途の優れた候補となる可能性があります8,9。

私たちの体の最大かつ不可欠な器官である皮膚は、外側の防御層です。乾燥布地（吸収性ガーゼまたは綿）などの古典的な創傷被覆材は、薬効がほとんどなく、痛みを伴い、被覆材を頻繁に調整する必要があるため、患者に継続的な苦痛を与えます。ハイドロゲルは、創傷部位の適切な湿度レベルを維持することで治癒を促進するため、有望です。ほとんどの創傷治療研究では、ハイドロゲルが天然の細胞外マトリックスに似た 3 次元構造を持ち、創傷を湿潤な雰囲気に保つため、ハイドロゲルが創傷被覆材の最良の候補であると考えられています 10,11。上皮の骨折と結合システムは、外的危害から十分に保護する人体の能力を支えています12。皮膚は、打撲傷や引っかき傷から火傷に至るまで、人体のすべての器官の中で最も傷つきやすいようです。統計的に、熱傷は外傷の中で 4 番目に頻繁に遭遇する衰弱性の形態です 13。熱傷は長期間の治療が必要となるため、理想的な熱傷包帯は短期間での回復を促進し、痛みを軽減することが期待されます。

過去 10 年間で、イガイにヒントを得たカテコール化学は、特にハイドロゲル 14 において科学の興味深い部分となってきました。ハイドロゲルでは、ポリアクリルアミドおよびビスアクリルアミド組成物がカテコールを捕捉したハイドロゲル系の共通のマトリックスとなっています 15。研究では、動物モデルにおいて、ポリアクリルアミドおよびビスアクリルアミドと皮膚との長期または頻繁な接触が皮膚炎やがんを引き起こす可能性があることが示されています16。前臨床所見は、動物モデル研究におけるポリアクリルアミドおよびビスアクリルアミド組成物への継続的な曝露が生殖系および神経系を損なったことを示唆しています17。市場では複数の包帯が容易に入手可能ですが、熱傷に対処するための革新的な創傷治療ソリューションを確立する必要があります。現在の研究は、「ポリドーパミンはヒドロゲル製剤の非毒性組成物中で接着特性を示す」という仮説に基づいています。そこで、GbH 創傷被覆材が開発され、さまざまな表面におけるその物理的および生物学的性能が評価されました。最後に、ラットモデルにおける第 2 度部分熱傷の創傷治癒における製剤の薬物拡散パターンを理解するために、創傷被覆材ヒドロゲルパッチからの薬物放出パターンの評価を評価しました。

本研究で採用された古典的な最適化は、生物からインスピレーションを得たポリドメインの粘着特性を備えた GbH の開発につながりました 2,18。 PVA ハイドロゲルは、加工の容易さ、生体適合性、非発がん性、生体接着性、非毒性および透明性の性質により、製薬および生物医学産業で数多くの用途があります。 PVA、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸などの合成ヒドロゲルをデンプンとブレンドすると、豊富なヒドロキシル基が確保され、機械的特性が向上します19、20、21。デンプンは自然界に豊富に存在するバイオポリマーであり、熱可塑性と効率的な生分解性を備えたコスト効率が高く、広く入手可能です。しかし、デンプンベースのシステムは機械的特性が低く、脆く、水溶性が高い特性を示すことが多く、合成ポリマーの修飾が有利であることが証明されています 21,22。現在の研究では、溶液流延プロセスから得られたグルタルアルデヒド試薬（GA）によって化学架橋されたPVA-デンプンヒドロゲルブレンド（図1a）は透明であり、粘着性や粘着性はありませんでした。 PVA-デンプンヒドロゲルのブレンドは、粘着性を追加するベースとして機能しました。様々な濃度のポリドーパミンをヒドロゲルベースに添加し、その後伸び試験を実施した（表１および２）。最低濃度の 0.5% では、創傷被覆材はあらゆる外力に耐え、創傷を保護する必要があるため、ヒドロゲル製剤に求められるように、弾力性があり、適切な粘着性があることがわかりました (図 1a.1)。

GbH の概略図と多様な性能：（a）開発された多様な表面ゼラチンベースのヒドロゲル（GbH）の概略図。 (a.1) 開発された GbH は、ポリビニルアルコール (PVA) とデンプンのポリマーと最適化されたアルカリ重合ポリドーパミン濃度がベースゲルとして機能するグルタルアルデヒド試薬 (GA) で化学的に架橋される 2 段階のプロセスです。 (a.2) 半重合段階の過剰なグルタルアルデヒドはゼラチンと架橋し、ベースゲル上にポリマーネットワークを形成します。ゼラチンネットワークは外部酸素を防ぎ、カテコール基の酸化を抑制します。ベネディクトテストを使用して、(b) PBS、(b.1) トリス-HCl、(b.2) AlCl2、および (b.3) 蒸留水に含まれる過剰なグルタルアルデヒドを測定しました。さまざまな表面に安定剤を備えた開発された GbH: (c) 鶏肉。 (c.1) 豚肉。 (c.2) ステンレス鋼の表面。 (c.3) ガラス表面および (c.4) プラスチック表面。

ゼラチンとメタ過ヨウ素酸ナトリウムを半重合状態で組み込むと、望ましい粘着特性が確保され、これは室温 (室温、22 ± 3 °C) で 4 日間持続しました。最良の組み合わせは、ポリドーパミンとメタ過ヨウ素酸ナトリウムの比率が 1:5 のゼラチン 500 μL であることが観察されました。イガイからヒントを得たポリドーパミン-ポリアクリルアミドヒドロゲルに関するこれまでの研究では、ヒドロゲル内に十分な遊離カテコール基が維持され、ポリドーパミンの過酸化が防止されていました4。イガイからインスピレーションを得たヒドロゲル内のポリアクリルアミドは、ポリマーネットワークを形成することによって外部の酸素を遮断し、カテコール基の酸化を抑制しました。ムール貝は本来、還元性のシステインに富むタンパク質を分泌することでカテコールグループの過酸化を防ぎ、強い接着力を維持します4。現在の研究では、ゼラチンネットワークが過酸化を防止し、カテコール基の即時酸化を妨げ、その結果、ヒドロゲルカテコールに長期にわたる粘着性を提供することができました。ベースゲルは PVA デンプンの架橋鎖によって形成されます (図 1a.2)。架橋剤 GA は、PVA の隣接する O-H 基と反応して、環状グリオキサール 23 を形成します。同じ架橋がデンプンと PVA の間でも起こります。 PVA-デンプン間の強力な水素結合相互作用もネットワーク形成を助けました。ポリドーパミンはまた、ベースゲルと相互作用して、構造グループに存在する NH との水素結合を形成します。過剰な GA はゼラチンを架橋し、ネットワークを安定にします 24。ポリドーパミンのカテコール部分は、正常組織内でさまざまな表面相互作用を受ける可能性があり、その結果、界面共有結合が形成されます 25。

GbH には洗浄処理を施し、過剰な GA を除去しました。したがって、過剰な C-H-O 官能基の除去を促進する適切な緩衝液は、ベネディクトテストによって決定されました 26。ベネディクトテストにおける濃い緑色からクリスタルブルーへの色の変化は、C-H-O 基が除去されたことを示しています。使用した緩衝液は、Tris-HCl (3 M)、塩化アルミニウム (AlCl2) (50 mM)、リン酸緩衝食塩水 (PBS) (0.1 M)、および蒸留水でした (図 1b-b.3)。ベネディクトテストにより、PBS が洗浄目的に理想的であることが明らかになりました（図 1b）。洗浄は 6 時間サイクルで 3 回実行され、その後バッファーが廃棄され、ゲル保存のために新鮮な PBS がゲルに再充填されました。 PBS または蒸留水中で 4 °C で。洗浄したゲルのフーリエ変換赤外分光法 (FT-IR) スペクトルも、GA が完全に除去されたことを裏付けています。 IR の詳細については、「GbH の特性」セクションで簡単に説明します。濡れた表面に対する GbH の粘着性は、ヒドロゲル上に存在する表面アミン基によって可能になります 27,28。 GbH をさまざまな表面上に保持し（室温で一晩）、表面に対する各ヒドロゲルの粘着性を観察しました（図 1c-c.4）。 GbH は、鶏肉 (図 1c.1) や豚肉 (図 1c.1) などのさまざまな湿った表面と、ステンレス鋼 (図 1c.2)、ガラス (図 1c.3) などの乾燥した表面に配置されました。およびプラスチック (図 1c.4)。金属、ガラス、豚肉への粘着性は鶏肉よりも強かった。

高分子電解質から合成されたヒドロゲルは、ポリマー鎖間の電荷反発によりさらに膨潤します29。膨潤などの特性は、制御された薬物放出にとって望ましい30。 GbH は包帯材として創傷ケア用に設計されているため、本製剤には 3 つの異なる薬剤が配合されています。シプロフロキサシン (抗菌薬)、5-フルシトシン (抗真菌薬)、ケルセチン (創傷治癒促進薬) (表 3)。本研究では、拡散される薬物の飽和および有効濃度に応じて、GbH にさまざまな濃度の薬物 (最小 5 mg/mL、最大 20 mg/mL) が充填されました。薬物をジメチルスルホキシド (DMSO) に可溶化し、200 μL の薬物をゼラチンにロードしました。創傷治癒には細菌防御と創傷治癒促進薬の両方が必要であるため、薬剤の組み合わせ（シプロフロキサシン（100μL）とケルセチン（100μL））の研究も実施されました。薬物を含まないGbHを、同等の特性の対照として含めた。

GbH はさまざまな溶媒中で良好な膨潤を示し、対照と同等でした (図 2a)。さらに、膨潤する性質により滲出液の吸収が促進され、傷の治癒に適した環境が促進されます。 GbH はどの試験溶媒にも溶解せず、血液に浸した GbH の膨潤率は血液成分によるものであることが観察されました 29。現在の研究では、薬物濃度が増加しても膨潤能力はほとんど損なわれませんでした。創傷被覆材の候補としては、体液の損失が制限され、創傷治癒に十分な湿った雰囲気が維持されるため、水蒸気透過率 (WVT) (表 4) 値が低いヒドロゲルが好まれます 22。報告によると、正常な皮膚からは平均約 250 g/m-2/d-1 の水分が失われますが、35 °C では、創傷では水分の損失が 5000 g/m-2/d-1 に大幅に増加します。そして損失は怪我の性質に基づいて決定されます31。薬物を充填した GbH は比較的低い WVT を有し、対照と同等であることが判明しました。水分の減少が大きくなるほど、傷の治癒は不可能になります32。したがって、膨潤、WVT、および水分保持能力（MRC）はヒドロゲルの必須パラメーターであり、滲出液の吸収を促進し、水の移動を制限して創傷治癒に役立つ状態を確保し、適切な薬物拡散を提供します。調製された GbH には適度に強い MRC があり (表 4)、すべての MRC 値は対照 (表 4) (薬物無負荷 GbH) と無視できるほどの差を示しました。その結果、GbH を蒸留水に 4 日間浸漬した後でも適切な架橋が形成されていることを示しました。調製された GbH は非常に強いゲル分率 (GF) (表 4) を持ち、すべての GF 値はコントロールと同等でした。

GbH の特性評価: GbH の物理的評価: (a) 水、NaCl 溶液、MgCl2 溶液および血液中での GbH の膨潤挙動。 SEM 画像: (b) および (c) 266 ～ 393 nm の細孔サイズ範囲の GbH を制御します。 (b.1) 抗菌シプロフロキサシン薬剤を充填した GbH。 (b.2) 創傷治癒を促進するケルセチン薬剤負荷GbH。 (b.3) 抗真菌薬 5-フルシトシンを負荷した GbH。 (b.4) 抗菌薬シプロフロキサシンとケルセチン担持 GbH の組み合わせ。 (c.1) サリチル酸放出前のパッチ-A GbH の SEM 画像。 (c.2) サリチル酸放出後のパッチ-A GbH の SEM 画像 (c.3) サリチル酸放出前のパッチ-B GbH の SEM 画像。 (c.4) サリチル酸放出後のパッチ-B GbH の SEM 画像。表面機能特性の図解: (d) 標準ヒドロゲルと GbH の FT-IR。（e）抗菌薬シプロフロキサシン（C）を担持したGbH、創傷治癒促進薬・ケルセチンを担持したGbH（Q）、抗真菌薬5-フルシトシン（5F）を担持したGbH、抗菌薬シプロフロキサシンとケルセチンを配合したGbH（Q）のFT-IR + C) ロードされ、抗真菌薬 5-フルシトシンとケルセチンを組み合わせた GbH (Q + 5F) がロードされます。 (f) パッチ A およびパッチ B の FT-IR。パッチの DSC 特性評価: (g) GbH および (h) パッチ-A および -B。 (i) パッチ-A およびパッチ-B としての GbH の XRD。

GbH の表面は走査型電子顕微鏡 (SEM) イメージングで緻密であることがわかり、非常に高倍率で 266 ～ 393 nm の範囲で細孔はほとんど見えませんでした (図 2b、c)。緻密な表面は、細菌が損傷部位に侵入して感染症を引き起こしにくいため、創傷被覆材として有益です15。 PVA デンプン配合物に関する同様の調査では、GbH 表面では見えなかった不溶性デンプン粒子が表面に存在することがわかりました 33。対照GbHと比較した場合に表面変化が観察されないことは、薬物がGbHと適切に（均一に/適切に）混合され、均一な薬物ローディングプロセスが確実に行われたことを示しています（図2b.1-4、b.1-4）。 GbH は本質的に半透明ですが、その色は充填された薬物に基づいて変更できます。ケルセチンおよび5-フルシトシンを添加すると、GbHの色はそれぞれ黄色および乳白色に変化した。

ヒドロゲルと GbH の IR スペクトル（図 2d）は、成分の分子間水素結合 O-H 伸縮に由来する 3300 ～ 3500 cm-1 の範囲に幅広いピークを示しました 34。 1636 cm-1で観察されたピークは、ポリドーパミンのNH振動に対応し（図2d）、これはすべてのスペクトルで明らかに見られました。スペクトルでは特徴的なアルデヒドのバンドが示されていないため、過剰なグルタルアルデヒドは存在しません。薬物を取り込んだ後でもO-Hバンドの強度の減少はありませんでした（図2e）。これは、その成分が寄与する親水性O-H基の豊富さを示しています。研究によると、ハイドロゲルの接着特性は主に、組織表面のヒドロキシル、アミノ、カルボキシルなどの化学基と相互作用するハイドロゲルの表面 O-H 基に関連していることが示されています 27、28、35。 1141 cm-1 のピークは、隣接する PVA 鎖間に形成された分子間水素結合によって生じる C-O 伸縮を明らかにしました 36。デンプンのC-O-C基のC-O結合によって示される伸縮振動は、GbHでは1025cm-1で見つかりましたが、ゼラチンのC-O伸縮に対応するピークは1080cm-1で見つかりました。 GbHのスペクトルでは1030 cm-1（図2d）。二級アミド基の存在により生じるピークは、1636 cm-1 のポリドーパミンの NH バンドと融合しました。 GbHのスペクトルは、それぞれの領域にその特徴的なピークをすべて保持しており、薬物の取り込み時に化学的相互作用や構造変化が起こらないことを明らかにしました（図2eおよびf）。

GbH の熱挙動は、示差走査熱量測定 (DSC) サーモグラムを使用して研究されました。 GbH の融解吸熱ピークは 199 °C で観察されます (図 2g)。これは主に PVA が主成分であるためと考えられます。ただし、ここで観察された Tm は純粋な PVA についての文献報告よりも低く、これは主に PVA 鎖と他の成分の間の相互作用により、GbH37 の非晶質の性質が原因です。 GbHは200℃まで熱的に安定ですが、薬物を組み込んだGbHは216℃でより高いTmを示しましたが、これは薬物とGbHの間の物理的相互作用に起因します（図2h）。結晶性または非晶質の特性は、粉末 X 線回折 (XRD) によって 2θ = 9.4° のピークで明らかになり、PVA38 の半結晶性ピークを示します。 9°の小さなショルダーピークの存在により、すべての場合でデンプンの存在が明らかでした（図2i）。ピークの強度は、薬物の組み込みにより減少した。パッチ A およびパッチ B のピーク強度の減少は、GbH の非晶質の性質を明らかにしています。

薬物放出プロファイルは、1% 薬物用量のサリチル酸を使用して評価されました。 2 つのアプローチが実行されました。パッチ A では、GbH が調製され、サリチル酸中に分散されました。パッチ-Bでは、溶液が蒸発するまでGbHを10 mLのサリチル酸アセトン溶液に浸漬しました。パッチの伸長試験は、薬物統合の方法がGbHの伸長を変化させないことを示した(表5)。パッチは、対照パッチ、すなわち薬物を含まないGbHと同等の伸びを示した。

パッチからの薬物放出の順序 (図 3a) は、パッチ A とパッチ B の両方が、一定期間内にそれぞれ 60.39 ± 2.25% と 57.08 ± 2.02% の制御薬物放出率 (CDR%) を示すことを示しました。 4時間。パッチ A とパッチ B は、徐放性を伴う同一のパターンを良好に示しました。したがって、調節された薬物放出パターンが観察されました。同等のゼラチンヒドロゲルの研究では、4 時間で 100% の薬物放出が記録されましたが、GbH では 60% の薬物放出しか示されませんでした。研究によれば、十分な溶解媒体がある環境では薬物の放出がより速く、3 時間で平衡に達することが示唆されています 39。パッチ A およびパッチ B は、それぞれ 13.48 ± 0.17 および 11.42 ± 0.15 mg の薬物負荷容量を有することが観察されました。薬物充填プロセスでは、GbH の特性にわずかな違いが見られ、パッチ B では伸長の点で部分的な損失が見られました (表 5)。溶液キャストシステムは効率的であり、現在の研究では薬物を充填する可能性が非常に高いです。寒天拡散薬物放出調査では、拡散したサリチル酸と塩化第二鉄の間の複雑な反応により、寒天プレート上に紫/紫の色が生成されました (図 3b、c)。グラフは薬物放出ゾーンと時間を示しており、これによって薬物放出ゾーンが決まります。薬物放出動態(図2c)。薬物放出により形成されたゾーンの直径に基づいて、GbH の制御放出特性が観察されました。サリチル酸の放出は遅く、時間に依存した環の拡大によって観察できた。 GbH は薬物の拡散性にとって理想的な製剤であることが証明されており、これはさらなる数学的速度論的観察によって説明できます。

経皮薬物送達システムの数学的モデリング：GbH からのサリチル酸放出の時間依存性評価：（a）パッチ A およびパッチ B のサリチル酸の制御薬物放出プロファイルの分光光度分析のグラフ。 (b) パッチ A およびパッチ B の制御された薬物放出プロファイルに関する寒天ウェル拡散試験の図。 (c) サリチル酸寒天ウェル拡散試験におけるパッチ-Aおよび-Bの制御された薬物放出プロファイルのグラフ図。 GbH からの薬物放出の数学モデル表現：（d）ゼロ次、（e）一次、および（f）ヒグチアン放出動態。 GbH の寒天拡散：（gA）大腸菌に対する UV 滅菌 GbH 性能。 (gB) 大腸菌に対する UV 滅菌 GbH 性能のコントロールプレート。 (gC) 黄色ブドウ球菌に対する UV 滅菌 GbH 性能。 (gD) 黄色ブドウ球菌に対する UV 滅菌 GbH 性能のコントロールプレート。 (gE) 大腸菌に対する非滅菌 GbH 性能。 (gF) 大腸菌に対する非滅菌 GbH 性能のコントロールプレート。 (gG) 黄色ブドウ球菌に対する非無菌 GbH の性能。 (gH) 黄色ブドウ球菌に対する非滅菌 GbH 性能のコントロールプレート。 (gI) C. albicans に対する UV 滅菌 GbH の性能。 (gJ) C. albicans に対する UV 滅菌 GbH 性能のコントロールプレート。 (gK) C. albicans に対する非滅菌 GbH 性能、および (gL) C. albicans に対する非滅菌 GbH 性能の対照プレート。（ｈ）ＧｂＨの寒天重層性能を示す。ここで、Ｅ、Ｓ、及びＣＡは、それぞれ大腸菌、黄色ブドウ球菌、及びカンジダ・アルビカンスを表す。 Cはコントロールプレートを示します。 C(H)はポジティブコントロールGbHを示します。 D(H)は被験薬を封入したGbHを示す。 (i) D1、D2、および D3 がそれぞれ 1 日目、2 日目、および 3 日目である GbH のパッチ寒天成績を示します。 E、S、CAはそれぞれ大腸菌、黄色ブドウ球菌、カンジダ・アルビカンスを表す。 Cはコットンパッチを示します。 D(C) は薬物を含んだ綿パッチを示します。 HはGbHを示し、D(H)は薬物を負荷したGbHを示します。

CDR% 値は、GbH 薬物放出パターンの統計モデル分析のためにさらに考慮されます。パッチ A およびパッチ B の薬物放出パターンのゼロ速度論 (図 3d)、一次速度論 (図 3e)、およびヒグチアン速度論 (図 3f) をプロットしました 40。グラフは、経皮薬物放出の製剤の統計的形式を反映しています。ゼロ次モデル分析では、in vitro 薬物放出試験からのデータが、放出された薬物の総量対時間としてプロットされます (図 3d)。この関係は、経皮システム、コーティングされた形態の低溶解性薬物を含むマトリックス錠剤、および浸透圧システムを含む薬物放出形態の薬物拡散を説明することができる41。一次モデルは、薬物残存対時間の累積対数パーセンテージを表し、-K/2303の傾きを持つ直線になります（図3e）。この関連性は、多孔質マトリックス中に水溶性薬物を含むものなど、処方薬の種類ごとに薬物の溶解を分類するために使用できます 41。ヒグチアン動力学は、時間の平方根に対する薬物放出の合計パーセンテージのみを扱います（図3f）。この相関関係は、経皮システムや水溶性薬物を含むマトリックス錠剤など、さまざまな種類の放出調節薬物製剤の薬物溶解を説明するために使用できます 41。

GbH マトリックスからのサリチル酸の薬物放出は、ゼロ次および一次反応速度論の概念に適合します (パッチ A では、それぞれ r2 = 0.984 および r2 = 0.99、パッチ B では、r2 = 0.894 および r2 = 0.95) (図) .3d、e）。パッチ-Aも比較的近い相関係数（r2 = 0.952）でヒグチアンカイネティクスに従いますが、パッチ-Bはパッチ-Aよりも低い値を持ちました（図3f）。パッチ-B は、パッチ-A と比較して、ゼロ次反応速度モデルの値が低くなります (図 3d)。同様に、ゼラチンベースのヒドロゲルの数学的モデルに関する以前の報告では、パッチ-B と同じ方法で開発されたヒドロゲルは、エステル化複合体がサリチル酸分子の放出を妨げるため、パッチ-A よりも薬物放出が低いことが明らかになりました 39。経皮薬物送達システムの数学的モデルの検証に従って、パッチ A は 3 つの薬物放出プロファイル、つまりゼロ、一次、ヒグチアンモデルに従いますが、パッチ B はパッチと比較して低い値を示しました。ゼロ次およびヒグチアンモデルの -A。同様の薬物放出パターンが、ポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコール-ポリカプロラクトンベースのヒドロゲルに閉じ込められたジクロフェナクナトリウムでも観察されています42。議論したように、パッチ A とパッチ B は、拡散プロセスでサリチル酸を放出する 3 つの運動法則すべてに従います。薬物は、マトリックス内に拡散するのに使用したのと同じチャネルを使用します。これは、パッチ-Aの薬物放出の前後のSEM分析によって確認できます（図2c.1、c.3）。放出前に観察された粗い表面は、パッチ-Bの薬物放出後のSEM画像(図2c.2、c.4)では滑らかな表面であり、対照GbHの表面(図2c)に匹敵する。 IRの結果（「GbHの特性評価」セクションと図2fで述べた）は、GbHの表面にO – H官能基が顕著に存在すること、および薬物負荷は表面官能基をあまり変化させないことを示しました。

ヒドロゲル包帯は主に創傷領域の湿潤を維持し、感染から保護します。 GbH の SEM 分析で観察された多孔性 (セクション:「GbH の特性評価」および図 2b、c) は、有効成分の高い局所濃度、徐放性、膨潤などの利点を示しています。 GbH からの薬物拡散は、寒天拡散、寒天オーバーレイ、パッチ寒天などの寒天ベースの方法を使用して、微生物 (大腸菌 MTTC 443、黄色ブドウ球菌 MTTC 96、およびカンジダアルビカンス MTTC 183) に対してテストされました。これらの方法は、GbH からの薬物放出効率と感染制御におけるそのパフォーマンスを示します。本研究では、表面滅菌済みおよび未滅菌の GbH (図 3 gA ～ gL) を寒天拡散法を使用してテストしました。 GbH は、薬物の低濃度および高濃度 (つまり 5 mg および 20 mg) の両方で強い拡散性を示します。観察された阻害ゾーンの 2 つの異なるリングは、GbH からの薬物の拡散が遅いためである可能性があります。滅菌済みまたは未滅菌のゲルは、GbH を介した薬物の拡散性にほとんど影響を与えません。寒天オーバーレイシステム（図３ｈ）は、より低い濃度（５ｍｇ）で薬物の強い拡散性を示し、試験薬物を含むＧｂＨは、対照と比較した場合、微生物の増殖を示さなかった。したがって、GbH は、細菌感染 (図 3g.A ～ gH) および真菌感染症 (図 3g.I ～ gL) に対する創傷保護に有効な選択肢です。

パッチ寒天調査（図3i）と同様に、テストとコントロールを、抗菌研究のために37℃でインキュベートしたグラム陰性大腸菌とグラム陽性黄色ブドウ球菌の綿棒に感染させました。抗真菌プレートに C. albicans を接種し、27 °C でインキュベートしました。この研究は3日間にわたって実施され、汚染領域から綿棒が採取され、それぞれ栄養寒天プレートおよびジャガイモデキストロース寒天プレート上で細菌および真菌の増殖が監視されました。今回の発見（図3i）は、薬物を負荷したGbHが、薬物および対照を含まないGbHと比較して、優れた抗菌活性を発揮することを示した。 1 日目から、薬物を添加した綿パッチサンプルで濃厚な微生物の増殖が観察されました。パッチ寒天システムの薬物を負荷したものと薬物を負荷しないものでは、GbH が強い拡散特性を備えた柔らかい創傷被覆材の包帯により感染を回避する能力があることが証明されました。。

GbH の毒性は MTT アッセイにより 3 つのレベルで評価されました。 L929 細胞株を使用した第 1 レベルのアッセイにより、適切な安定剤の選択が可能になり、GbH が無毒になりました。第 2 レベルのアッセイでは、GbH (GbH 浸出液) と 3T6 細胞株の間接的接触中の細胞生存率を決定します。最後に、第 3 レベルでは、HaCat 細胞を使用した GbH の直接的および間接的 (GbH 浸出液) 接触に対する GbH の不活性性が証明されました。ケルセチン (QU)、オイゲノール (EU)、ビタミン C (Vc)、メタ過ヨウ素酸ナトリウム (SmP) などのさまざまな安定剤を、異なる濃度 (1:0.5、1:1、1:1.5 および 1: 2）ポリドーパミンと安定剤の比率（図4a）。興味深いことに、ポリドーパミンとメタ過ヨウ素酸ナトリウムの比率が 1:1 の場合、約 50% という妥当な細胞生存率が観察されました。したがって、ポーランドの標準を使用する第 2 レベルのアッセイの安定剤として SmP が選択されました 43。 3T6 細胞における生体材料浸出液培地の毒性の MTT 評価により、その非毒性特性が明らかになりました。ここで比較したポリドーパミンと安定剤 SmP の比率 (1:1、1:2、1:3、および 1:4) のうち、1:4 は > 80% の細胞生存率を示しました (図 4b)。増殖培地の100％を生体材料浸出液培地に置き換えて、さまざまな量でテストしました（図4c）。生体材料浸出液培地のさまざまな割合 (25、50、および 100%) を交換したにもかかわらず、3T6 細胞の生存率に対する GbH の大きな悪影響はなく、対照、つまり PVA デンプンヒドロゲルおよびGBHベース。最終的な MTT アッセイは、GbH の直接的および間接的接触 (図 4d.1) という 2 つの異なる方法を使用して、HaCat 細胞株で実行されました (図 4d)。細胞生存率は影響を受けず、つまり両方の試験方法で 100% であり、観察された値は増殖対照と同等でした (図 4d)。

Ⅱ度熱傷の被覆材としての GbH の in vitro および in vivo 性能：L929 細胞を用いた GbH の細胞毒性評価：（a）GbH に 24 時間曝露したときの L929 の細胞生存率。ここで、Hb はヒドロゲルベースであり、安定剤、凡例は各試験安定剤の濃度 (mg) を示します。 (b) GbH 浸出液培地に 24 時間曝露したときの 3T6 の細胞生存率。Ctr は安定剤を含まない GbH 塩基で、凡例はポリドーパミンとメタ過ヨウ素酸ナトリウムの比を示します。(c) 浸出液に曝露したときの 3T6 の細胞生存率。 GbH 浸出液をさまざまなパーセンテージで 24 時間培地に浸出させます。ここで、Ctr は安定剤を含まない GbH 塩基であり、比率の凡例は GbH 中のポリドーパミンとメタ過ヨウ素酸ナトリウムの比率を示しています。（ d ）GbHが細胞と接触し（GbHが配置されている）、100％培地交換で浸出液培地が24時間インキュベートされたときのHaCatの細胞生存率。Ctrはコントロールを示し、Ctr 37°Cはポジティブコントロールを示します。 (d.1) GbH と接触させて 24 時間後に健康な HaCat 細胞が観察されたイベント。白い矢印は GbH を示し、黒い矢印は 96 ウェルプレート内の健康な HaCat 細胞を示します。 GbHに24時間曝露したときのブラインシュリンプの発達が観察された。(e)ポジティブコントロール:曝気タンクからのノープリウス。 (e.1) 対照: 人工海水中のノープリウス。 (e.2) および (e.4) 試験: GbH リーチ緩衝液と人工塩水の 1:1 培地におけるノープリウス。 (e.3) および (e.5) 試験: GbH を人工海水媒体中のブラインシュリンプに入れました。ゼブラフィッシュモデルの胚および稚魚段階における短期毒性試験：（f）GbH（GbH直接接触および1：1培地、すなわちGbHリーチバッファーとE3培地）に18年間曝露した場合のゼブラフィッシュの発生が観察された。 –96 hpf; (f.1) GbH と接触した 48 hpf での健康なゼブラフィッシュの卵を観察。ラットの皮膚の組織病理学を示す顕微鏡写真。対照群の雄（g）および雌（g.1）ラットの上皮の正常な外観。雄 (g.3) および雌 (g.4) ラットの表皮腫は最小限。対照ラット(g.2)における真皮の外観は正常であり、処置群(g.5)における炎症細胞浸潤は最小限である。

GbH の直接的および間接的接触の影響は、ブラインシュリンプ (Artemia salina) およびゼブラフィッシュ (Danio rerio) の胚を使用した in vitro モデルベースのアッセイを通じて調査されました。ブラインシュリンプ致死試験は、細胞毒性を評価するための迅速な試験です44。リン酸緩衝液に浸漬した GbH を 35 ～ 37 °C で 24 時間インキュベートし、ブラインシュリンプアッセイの試験溶液として使用しました。 24 時間孵化したノープリウス (n = 10) に、試験溶液と人工海水の異なる比率 (1:4、1:1、1:0) で接種しました。体の大きさと触角毛が健全に成長し、活発な幼体がノープリアール期まで成長することは（図4e-e.5）、GbH試験溶液の非毒性の性質を示しています。海水に浸漬した GbH を直接接触させたサンプルでも、ノープリウスと同様の成長パターンが見られました。間接アッセイで使用した 1:0 の比率では 10% の死亡率が観察され、これは塩水含有量が低いことが原因と考えられます。一方、GbH に浸したサンプルが直接接触した場合は、ノープリウスが GbH に絡まっていたため、死亡率 15% が観察されました。 (図4e.5)45．インキュベートしたプレートおよび通気した水槽で維持した対照は、同様のノープリア成長パターンを示しました。

ゼブラフィッシュ胚（n = 10）を使用した魚類胚試験（FET）アッセイ（図4f、f.1）は、E3培地を使用してわずかに変更を加えたブラインシュリンプ致死性アッセイと同様に実施されました46。胚を毎日観察して、OECD 化学物質試験ガイドライン No. 212: 魚、胚および稚魚の短期毒性試験に従って、GbH への直接曝露および GbH 浸潤試験溶液への曝露による発育変化を記録しました。ステージ47、48。頂端観察は、受精後96時間（hpf）まで24時間ごとに各試験胚（図4f、f.1）で実行され、胚の発生に対するGbHの毒性の重症度評価（表6）が行われました。記録されました。その他の観察には、目の発達、動き、血液循環と色素沈着、頭身の発達、絵の鰭と突き出た口が含まれていました49。さらに、処理群と対照群の両方で約72時間での孵化の開始が記録されました（図4f、f.1）。重症度スケーリングにおける陰性結果（表６）は、ＧｂＨとの直接的および間接的接触によるゼブラフィッシュ胚の健全な発育を示した。

急性経皮毒性実験は、化学物質の試験に関する OECD-402 の規制ガイドラインに従って実施されました50。毒性範囲測定および確認研究は、順応後に選択された健康な Wistar アルビノラット (n = 10) を使用して実施されました。試験物質であるＧｂＨは、観察期間（１４日間）を通じてウィスターアルビノラットで試験した場合、死亡も引き起こさず、毒性の臨床徴候も示さなかった（表７）。 OECD-402 の試験条件下では、実験ではラットにおける GbH の皮膚 LD50 は得られず、製剤は 2000 mg/kg 体重 (> 2000) まで無毒性でした。 GbHに曝露されたラットは実験プロトコールを生き延び、剖検が必要なかったため屠殺された(表8)。組織病理学的結果（図4g-g.5）は、男性および女性のグループのGbHの適用領域に炎症や異常の兆候を明らかに示していません。

インビトロ引っ掻き傷アッセイは、培地中のGbHおよびケルセチン負荷GbHの浸出液に曝露されたHaCat細胞の引っかき傷における効率的な細胞遊走を実証した（図5a）。生体材料浸出液媒体に曝露してから 24 時間以内に、対照と比較して細胞単層の傷が部分的に閉じました。間隔を置いて撮影された画像は、創傷閉鎖のための効率的な細胞遊走に有利な GbH の非毒性性質を証明するものとして認定されました 51。 HaCat細胞のコンフルエントな細胞単層上の人工ギャップ「スクラッチ」の閉鎖が観察され、新たに生じたギャップの端にある細胞が開口部に向かって移動して「スクラッチ」を閉じた。したがって、ケルセチンをロードしたGbHとロードしていないGbHで新しい細胞間接触が再び確立されました（図a。24 hQ-GbH）。ケルセチンによる低レベルの免疫細胞浸潤およびサイトカインによるインビトロ虚血スクラッチアッセイの効率的な創傷閉鎖に関する同様の観察が報告されている 52。異なる量のカルボポールとゼラチンで開発されたケルセチンを充填したリポソームの分析に関する以前の報告では、損傷の治癒が促進され、創傷閉鎖時間が大幅に短縮されました53。多くの研究者が、創傷治癒を促進するモデル薬としてケルセチンを開発しました54,55。

GbHの創傷治癒性能：（a）GbHインキュベート培地を100％置換したHaCat細胞の引っ掻き傷治癒性能。（b）ノーマル、コントロール、クリームベースグループ（クリーム）、ケルセチン配合クリーム（QC）、GbHベース（ハイドロゲル）、ケルセチン配合GbH（QH）およびスルファジアジン銀（SS）処置群における皮膚引張強度の変化。結果は、各グループの n = 6 の平均 ± SD として表され、正常グループと比較して p < 0.05 でした。対照群と比較して、bp < 0.05; cp < 0.05、クリームグループと比較、dp < 0.05、QC グループと比較、ep < 0.05、ヒドロゲルグループと比較、fp < 0.05、QH グループと比較、gp < 0.05、SS グループと比較。 (c) 4 日目、7 日目、11 日目、14 日目、および 21 日目の熱傷の収縮に対する治療の効果 (%) は、対照群およびプラセボ群と比較して、優れたより速い創傷収縮でした。 (d) 正常、対照、クリーム、QC、ヒドロゲル、QH、およびSS処置群の創傷収縮の変化。

火傷を負ったウィスターラットの栄養摂取量、水分摂取量、体重は変化しませんでした。熱傷の直後、背部の皮膚は腫れを示しました。病変は4日目の時点で赤い斑点の形で明らかであり、7日目までに壊死組織が痂皮で覆われていることが判明した。

創傷の早期上皮化（表９）は、１％ケルセチンＧｂＨ処置群（ＱＨ）およびスルファジアジン銀（ＳＳ）を投与した処置群で観察された。対照群は21日目まで適切な創傷治癒を示さなかったが、QHとSSはそれぞれ14日目と16日目から創傷の早期上皮化を示した。プラセボ群（すなわち、クリームベース治療群（クリーム）およびＧｂＨベース治療群（ハイドロゲル））は、１６日目および１７日目から早期上皮形成を観察した。プラセボ群は、薬物を配合したＧｂＨおよびクリーム製剤のプラスの効果を示している。

試験組織標本は機械でクランプされ、標本を引き裂くために発生した最大の力が組織の品質を示しました。対照群とすべての治療群の間で組織引張強度（図5b）の有意差（p < 0.05）が観察されました。火傷の治療の必要性を示し、QH グループと SS グループの引張強度はそれぞれ 24.4 と 23.37 N でしたが、対照グループは 3.77 N を記録しました。QH グループと SS グループのより優れた引張強度は同様の範囲でしたが、QH グループと SS グループの引張強度は同様の範囲でした。治療されたクリームおよびヒドロゲルベースのプラセボ群は、薬物配合製剤と比較して、10.1 N および 19.32 N と有意差 (p < 0.05) を示し、したがって熱傷治癒における GbH の積極的な役割が強調されました。 QH および SS の引張強度の回復は、21 日目までに 28.45 N の引張強度で皮膚が正常化していることを証明しました。

創傷収縮のパーセンテージ（図5c、d）は、対照群と比較してQHおよびSSグループで有意に高かった（p < 0.05）。ラットモデルにおける第 2 度熱傷における GbH 媒介の創傷閉鎖の結果は有益であることが証明されています。 QH 処置動物は、SS 処置動物 (4 日目 47.67 ± 1.8%、14 日目 96.4 ± 2.2%) よりも実質的な創傷閉鎖 (4 日目 45.00 ± 1.46%、14 日目 98.24 ± 3.1%) を示しました。 4日目と14日目の未治療対照群（4日目で18.00±2.5％、14日目で54.52±1.25％）（図5、d）。肉眼的形態学的研究では、14 日目の QH グループでは炎症と発赤が減少し、瘢痕化が限定的であることが示されました。また、QH および SS 治療創傷では表皮が正常な皮膚構造に若返った一方、炎症と早期創傷閉鎖の兆候が観察されました。 21日目の対照群（図5d）

QH処理した組織サンプルのマロンジアルデヒド（MDA）レベル（図6a）は、0.814 nmoles MDA/mLとして記録され、2.147 nmoles MDA/mLの対照（p < 0.05）グループよりも低かったのに対し、正常な皮膚は次のように記録されました。 0.705 nmol MDA/mL。対照群の MDA の大幅な増加 (p < 0.05) は、過酸化脂質損傷の兆候であり、フリーラジカル損傷を意味し、21 日目までに創傷治癒が不完全になります。QH および SS 治療群の MDA レベルは 0.814 および 0.827 でした。それぞれ nmol MDA/mL であり、互いに同一であり、正常な皮膚組織に匹敵します。 QH 処理サンプルの MD レベルの低下は、熱傷治癒中の脂質過酸化の軽減と抗酸化保護におけるケルセチンの効果を示しています。マートル (Myrtus Communis) の経口および局所治療を使用することによる、火傷誘発性の酸化傷害に対する抗酸化保護が以前に報告されています 56。したがって、生化学指標の逆転は、抗炎症化合物の潜在的な抗酸化作用に起因すると考えられます。

in vivo の創傷治癒の変化 (a) MDA。 (b) GSH。 (c) CAT。 (d) HXP。 (e) ノーマル、コントロール、クリームベースグループ (クリーム)、ケルセチン配合クリーム (QC)、GbH ベース (ハイドロゲル)、ケルセチン配合 GbH (QH)、およびスルファジアジン銀 (SS) の HXA および (f) NF-κB レベル治療を受けたグループ。結果は、各グループの n = 6 の平均 ± SD として表され、正常グループと比較して p < 0.05 でした。対照群と比較して、bp < 0.05; cp < 0.05、クリームグループと比較、dp < 0.05、QC グループと比較、ep < 0.05、ヒドロゲルグループと比較、fp < 0.05、QH グループと比較、gp < 0.05、SS グループと比較。ケルセチン相互作用の 2-D および 3-D 画像：（g）および（g.4）1SVC ターゲット相互作用。 (g.1) および (g.5) 3BRV ターゲット相互作用。 (g.2) および (g.6) 1NFI ターゲット相互作用、および (g.3) および (g.7) 2E7A ターゲット相互作用。

非酵素的抗酸化物質と酵素的抗酸化物質、つまりそれぞれグルタチオン (GSH) とカタラーゼ (CAT) は、活性酸素のレベルとその意図する害を動的に調節する際に重要な役割を果たし、創傷治癒を促進します 57,58。対照サンプルでは、GSH（図6b）およびCAT（図6c）レベルは、それぞれ利用された過酸化水素2.24μmol/gおよび14.83μmol/mg/組織/分として記録された。処置群および正常群と比較した場合、対照群ではGSH（図6b）およびCAT（図6c）レベルの有意な低下が観察された（p<0.05）。 QHおよびSS治療群は、GSH（それぞれ2.13および2.14μmol/組織g）およびCAT（利用された過酸化水素22.41および25.341μmol/mg/組織/分）の正常な組織機能を回復することを目的とした。 2.24μmol/g組織GSHおよび30.182μmolの過酸化水素/mg/組織/分のCATを使用した正常群のもの（図6bおよびc）。 QH は、プラセボと比較して、21 日目までに GSH および CAT レベルを有意に回復しました (p < 0.05) (GSH: 1.48 および 1.8 μ mol/g、CAT: 利用された過酸化水素 15.533 および 18.207 μモル/mg/組織/クリーム群およびヒドロゲル群では1分）、および1％ケルセチンクリームベースで処理した群（QC）では、それぞれ1.65μmol/g組織および28.554μmolの過酸化水素を使用/mg/組織/分で使用した。

試験組織中のヒドロキシプロリン (HXP) およびヘキソサミン (HXA) レベルは、観察される治癒と相関する可能性があります。 HXP はコラーゲンの重要な要素であるのに対し、HXA は結合組織成分を構築するための基質です 59。したがって、HXP および HXA レベルは、創傷治癒における結合組織マーカーの完全な候補となります。治癒過程中、HXPおよびHXAの含有量は、対照群と比較してすべての治療群で増加しました（図6dおよびe）。治療を行わなかった熱傷群の HXP および HXA レベルはそれぞれ 38.911 および 40.477 μg/mL で、正常群のそれぞれ 97.546 および 107.752 μg/mL と比較して有意に低かった (p < 0.05)。 QH および SS グループは、21 日目までに正常グループで観察された 97.546 および 107.752 μg/mL と同様に、HXP および HXA 機能レベルが 83.053 および 76.343、95.698 μg/mL および 89.22 μg/mL に回復しました。QH は実質的に回復しました ( p < 0.05) プラセボ群 (HXP: 52.858 および 58.729 μg/mL、クリームおよびハイドロゲル群の HXP: 63.559 および 66.898 μg/mL) および QC (HXP: 68.160 および HXA:興味深いことに、SS グループは、QH グループと同様に、76.343 および 89.221 μg/mL の組織 HXP および HXA レベルを記録しました。対照組織含有量における HXP および HXA レベルの大幅な減少は、コラーゲンレベルが低く、結合組織形成が不十分であり、創傷治癒プロセスが不十分であることを示しています。したがって、QH 治療グループでの観察は、製剤の意図された治癒特性を強調しています。

NF-κB の機能は、炎症と細胞生存を調節し、細胞接合部の再構築と創傷周囲の細胞骨格構造の構築を促進するため、創傷治癒においていくつかの役割を果たします 60。対照群の NF-κB レベルは 5.88 ng/mL で、正常群の 3.95 ng/mL と比較して有意に高く (p < 0.05)、炎症が持続していることを示唆しています。 QHおよびSS処理グループは通常のNF-κB機能レベルを回復し、正常グループ（図6f）の組織NF-κBレベルと同様の3.61および3.52 ng/mLで観察されました。 QH は、プラセボ (クリームおよびハイドロゲル群の組織 NF-κB レベル 5.11 および 4.75 ng/mL) および QC 治療群 (組織 NF-κB レベル 4.46 ng/mL) と比較して、NF-κB レベルを実質的に回復しました (p < 0.05)。したがって、この結果は、創傷治癒を促進し、正常な皮膚組織と同様のNF-κBの期待される機能を回復することにおけるGbHの効果を強調している。

転写因子 NF-κB と多機能サイトカイン TNF-α は、細胞の生存、増殖、分化、死などの細胞事象において主要な役割を積極的に果たす強力な炎症性メディエーターです 61。研究者らはケルセチンを創傷治癒を改善するためのモデル薬剤として十分に確立しており 53,56 、今回の研究ではラットモデルにおける二次熱傷の回復におけるケルセチンを添加したGbHの有益な効果を強調している。潜在的な炎症性メディエーター標的に対するケルセチンのインシリコ分析 (図 6g-g.8 および表 10) では、優れた結合スコアと複数のアミノ酸への水素結合が観察されました。この化合物はタンパク質1SVCのp50ドメインに結合し、核に移行し、そこでDNAに結合します（図6g、g.4）。 3BRVのコイルドコイル領域は、位置49〜356の間にあります（図6g.1、g.5）。多くのコイルドコイル型領域は、遺伝子発現の制御などの重要な生物学的機能に関与しています。 3BRV の 44 と 111 の間の領域は CHUK/IKBKB との相互作用に積極的に関与し、IKK を介した RelA/p65 のリン酸化を可能にし、全体として NF-κB 活性化を通じて炎症反応を積極的に促進します。 1NFIの19と306の間のドメイン領域（図6g.2、g.6）は、RelA標的遺伝子プロモーターのアクセス可能性を機能的に調節します。ケルセチンは 1NFI ドメイン領域のアミノ酸と水素結合を形成し、機能的に不活性になります。タンパク質 2E7A の 105 位および 108 位での突然変異誘発 (図 6g.3、g.7) により、低活性および不活性が生じています 62。現在のドッキングは、2E7A の活性領域におけるケルセチンの結合を強調しています。

正常な皮膚（図７ａ）は、組織病理学的評価において、明確に定義された表皮および真皮層を有する構造を示す。上皮層 (x) は無傷であり、炎症の兆候はありません。真皮には多くの皮脂腺 (b) があり、真皮の上層には明確に定義されたコラーゲン線維 (c) があります。対照群(図7a.1)では、表皮が完全に消失し、表皮層が実質的に破壊されています(d)。基底細胞層における空胞細胞質の崩壊は、損傷部位への好中球浸潤 (f) とともに顕著です (e)。皮膚は表皮と真皮の凝固を示し、変性コラーゲンは腫れており（g）、均質で、滲出細胞が浸潤しているように見えます。プラセボ群、クリームベースで治療した群（図 7a.2）は、中程度の炎症を伴う火傷治癒組織を示し、上皮または真皮の再生の兆候はありませんでした（h）。基底細胞層は変性したままであり (i)、著しく空胞化されており、治癒の阻害を示しています。コラーゲン線維は変性したままであり (j)、微小血管再生の兆候はありません。同様に、プラセボ群、ヒドロゲル塩基処理群（すなわち、GbH）（図7a.4）は、再生成長の何らかの兆候を伴う上皮を示します（k）。基底細胞層の空胞化のわずかな減少 (l) は組織の治癒を示し、コラーゲン線維の膨張の減少は明らかです (m)。

21 日目の熱傷の組織病理学的評価: 正常群の組織病理学的検査の顕微鏡写真で、表皮、真皮、および皮下組織の標準的な形態が見つかりました (a)。対照群(a.1)は、真皮および表皮における火傷のかさぶたの発達、極度の白血球凝集、血管、毛包、および皮脂腺の鬱血という顕著な特徴を有することが観察された。中等度の白血球、血管破壊、および毛包および皮脂腺の変性が、クリームおよびGbH (ヒドロゲル) プラセボ群の局所塗布で観察されました (a.2) および (a.3)。ケルセチン薬剤処理クリーム、GbH グループ (QC、QH)、およびスルファジアジン銀 (SS) (a.4)、(a.5)、および (a.6) は、上皮再生に有利な白血球蓄積の症状を示さなかった。修復された皮膚の構造は、正常な皮膚と同様に、ケルセチンを配合した GbH の局所適用による表皮の再生を反映しています。

薬物を添加したクリームで治療したグループ、すなわちQC（図7a.3）は、表皮層と真皮層の分化が明らかな層（q）を再生することを目的としていました。基底細胞層の重要な構造的修復は、浮腫の顕著な減少と空胞化の無視できる兆候の形で見られます (r)。しかし、真皮層の治癒は、コラーゲン線維内に小さな空胞が存在するため不完全なままです。薬物補助GbH治療群、すなわちQHでは、顕著な上皮再生が観察されます(図7a.5)。表皮層と真皮層の分化は、正常な組織構造にほぼ回復しているように見えます (t)。皮脂腺 (u) の存在は、皮膚組織機能の生理学的回復を示します。基底細胞層は形状と構造が正常に見え、炎症の兆候はありません (v)。真皮のコラーゲン線維は、腫れやその他の炎症性の特徴を示しません (w)。 SS クリーム処置グループの陽性対照 (図 7a.6) は、明らかな上皮再生を示しています (n)。基底細胞層は、空胞化の大幅な減少によって明らかな回復変化を示します (o)。ただし、コラーゲン線維 (p) の腫れと浮腫は依然として低レベルで観察されます。

皮膚は私たちの体の最大かつ不可欠な器官であり、外側の防御層です。皮膚の損傷はさまざまな機能に影響を与え、患者の作業能力や自立性を損ないます。熱傷は外傷的な経験であり、傷の重症度によっては、創傷治癒の遅さ、感染、痛み、肥厚性瘢痕化が依然として熱傷の研究と管理における大きな課題となっています63。熱傷は熱に直接さらされるため毛細管透過性が高く、血漿が毛細管から間質部に漏れ出します。熱傷状態の間、血漿漏れと毛細管透過性の増加は 48 時間まで持続し、最初の 8 時間で最大になります。火傷は敏感であり、患者は傷の重症度に応じて痛みを感じます。血漿漏れと全身の毛細管透過性の出現は、熱傷に特有の現象です64。現在の研究は、ポリドーパミンの生物由来の特性により粘着性のある柔らかい創傷被覆材に焦点を当てています。このような柔らかい創傷被覆材は、ヒドロゲルの粘着性が極度の接着力や強さではないため、火傷の治療に有益となり得る。多くの市販されているゼラチンベースのシーラントでは、組織接着剤は組織の修復に有益です 1,8,18。このような組織損傷の場合は、標準的な臓器の機能を回復するために直ちに対応する必要があります。外傷や手術に伴う重大な損傷では、組織接着剤は強力で堅牢、弾性があり、毒性がなく、さまざまな表面接着を行うことが期待されます8。

溶液キャスト法によって調製されたヒドロゲルブレンドは半透明であり、粘着性を示さなかった（図８ａ）。 PVA デンプンのブレンドと GA で架橋されたものは、粘着特性をさらに組み込むためのベースとして機能しました。最近の生物からインスピレーションを得た研究では、ヒドロゲルのポリマー特性を変更する傾向があります 2,18。アルカリ重合ドーパミン65を使用して、ポリアクリルアミドおよびビスアクリルアミドヒドロゲルシステムに多様な表面粘着特性を誘発する実践は、さまざまな研究者によってその発がん性効果が確立されているにもかかわらず、以前に報告されています46。本研究は、アルカリ重合ドーパミンを使用して、生体適合性の高い組成物と、さまざまな表面に粘着できる費用対効果の高い生体からインスピレーションを得たハイドロゲルを目的としています。 GbH の物理的特性の推定値は、創傷の生理学的状態を模倣するさまざまな溶媒中で良好な膨潤特性を示しました (図 8a)。高分子電解質ベースのヒドロゲルは、ポリマー鎖上の電荷反発により、制御された薬物放出を達成するのに有益であることが証明されている 29,30。熱傷は、正常な創傷と比較して、5000 g/m-2/d-1 というより顕著な体液損失を示します。 GbH の現在の組成は、低い WVT 値と高い MRC 値を報告しており、対照と同等です 31。膨張率 WVT、MRC、GF の重要なパラメーターにより、滲出液の吸収が可能になり、創傷からの水分の移動が軽減されます。したがって、適切な薬剤の拡散を提供することにより、効果的な創傷治癒のための条件が確保されます。

現在の研究における GbH のハイライト：（a）第 2 度熱傷治療のための、生体からインスピレーションを得たゼラチンベースの多様な表面粘着性ヒドロゲルの開発。 (b) カテコール基と熱傷領域の表面相互作用の概略図。 (c) 軟創傷パッチと創傷組織との相互作用。柔らかい創傷パッチ。 (d) 第 2 度熱傷に QH を配置。 (e) ドレッシングの 3 日目 (矢印) で観察できる創傷修復、および (f) 滲出液の吸収: 理想的なヒドロゲルの特徴。

インビボ皮膚創傷被覆材、ＧｂＨ（表１１）は、皮膚組織再生の促進を実証した。 GbH は、ラットモデルに残留物や痛みを残すことなく簡単に除去できました。粘着性のある GbH は、その多様な表面性能を裏付けています。ポリドーパミンの遊離カテコール基は、組織表面のアミン基と相互作用します (図 8b)25。熱傷の治癒は、対照群では 1 日目から 7 日目まで一定のままでした。一方、3 日目の時点で、熱傷治療群の大部分では治癒の程度が一般的でした。ほぼすべての治療群の組織病理学的分析で治癒が示されました。しかし、QH はクリーム製剤治療グループよりも良好で早い治癒過程を示し、SS 治療グループと同様でした。 GbH 製剤は、クリーム製剤よりも 3 日ごとに新しい製剤と交換できるという利点がありますが、クリーム製剤は毎日塗布する必要があります。軟創傷被覆材としての GbH (図 8c) はラットに痛みを与えず、第 2 度熱傷または GbH 被覆材の損傷によるラットの発赤や食事習慣の顕著な変化はありませんでした (図 8c)。 8d）。

本研究の注目すべき発見は、ケルセチン添加GbH治療（QHグループ）の3日目に創傷境界に沿ってピンク色で新鮮な細胞が発生したこと（図8e）ですが、これは他の治療グループには当てはまりませんでした。創傷治癒の促進におけるケルセチンの投与量に関する最近の発見は、インビトロ細胞スクラッチアッセイにおいてマイトジェン活性化プロテインキナーゼの阻害およびNF-κB活性化に有利であり、これが圧迫損傷の治癒に寄与した52。同様に、プラセボ群も、今回の研究で、ケルセチンを配合したGbHが第2度熱傷の治癒に顕著な効果を示していることを確認した。異なる量のカルボポールとゼラチンで開発されたケルセチンを充填したリポソームの分析に関する以前の報告では、損傷の治癒が促進され、創傷閉鎖時間が大幅に短縮されました53。多くの研究者が、創傷治癒を促進するモデル薬としてケルセチンを開発しました54,55。同様に、現在の研究では、ラットモデルにおける二次熱傷の治癒におけるケルセチンを補充したGbHのプラスの効果も強調しています。創傷の治癒を促進するために、滲出液を吸収し、清潔で湿った治癒環境を維持するヒドロゲルの特性（図8f）は、本研究におけるGbHの他のハイライトの一部でした。

創傷治癒は、湿った暖かい環境などのさまざまな要因が関与する複雑なプロセスであることを考慮することが重要です。したがって、「湿潤創傷治癒理論」に基づくと、湿潤治癒状態は肉芽組織の発達と真皮細胞の分離の促進に理想的です。 GbH 製剤はそのような重要な要素を認識し、過剰な滲出液を吸収し、酸素と水蒸気の交換を可能にすることで迅速な創傷治癒を促進します。微生物の侵入も防ぎます。今回の研究で配合された GbH は、非毒性、非アレルギー性で、便利で費用対効果が高いです。制御された薬物送達機能と特性を備えており、医療用インプラントや湿ったまたは乾いた創傷表面などのさまざまな表面に貼り付けることができます。 GbH は、皮膚の細菌または真菌感染を制御するための予防的抗感染パッチとして使用できます。開発された GbH は、ラットモデルにおける 2 度部分熱傷に対する理想的な創傷被覆材として検証されました。上記の発見は、GbH の生物由来の製剤がラットモデルにおける 2 度熱傷の創傷治癒と皮膚修復を改善できるという事実に結実し、その前臨床使用が検証されました。

材料と方法の詳細な説明は、「SI 材料と方法」を参照してください。

この実験は、インド、ガーズィヤーバード-201302、MG ロード、UPSIDC、F-209、産業研究毒性研究所で実施され、実験にはプロジェクト番号: 202112-25 というラベルが付けられました。レポート番号: IIRT/TOX/202112/ADT/0112; 日付: 2021 年 14 月 12 日。すべての方法は、インドのニューデリーにある動物実験の管理および監督目的委員会（CPCSEA）のガイドラインおよび規制に従って実行されました。現在の研究で実施された方法は、ARRIVE ガイドライン 2.067 に準拠しています。急性皮膚毒性研究、治療グループ、実験計画の詳細を記載したプロトコルは、SI Materials and Methods に記載されています。皮膚毒性研究のプロトコールは 14 日間で、小動物麻酔システムを使用してイソフルランの過剰摂取により動物を安楽死させました。

体重 250 ～ 300 g のラット (雌雄問わず) を、インド、ハリヤナ州ヒサールにあるララ・ラジパット・ライ獣医動物科学大学 (LUVAS) の無病小動物舎施設 (DFSAH) から調達しました。すべての方法は、インドのニューデリーにある動物実験の管理および監督目的委員会（CPCSEA）のガイドラインおよび規制に従って実行されました。現在の研究で実施された方法は、ARRIVE ガイドライン 2.067 に準拠しています。動物は、実験前の 7 日間、順応させるために中央動物舎施設 (CPCSEA 登録番号 1753 Wistar /PO/E/S/14/CPCSEA) で隔離および収容されました。実験動物は 7 つのグループ (n = 6) に分けられ、プロトコル期間は 21 日間でした。 21日後、小動物麻酔システムを使用してイソフルランの過剰摂取により動物を安楽死させた。第 2 度熱傷の誘発、治療グループ、実験計画について詳しく説明したプロトコルは、SI Materials and Methods に記載されています。

動物に麻酔をかけ、首を切断して屠殺し、皮膚組織サンプルを収集し、標準プロトコールに従って処理した。組織学的観察に使用したサンプルは、10% 中性緩衝ホルマリンに沈着させました。上皮化や創傷収縮の時間を含む建設的な薬理学的基準は、定期的なプロトコルによって監視されています68。火傷治癒した皮膚の質を正常群と比較して、創傷伸張機、EFG500E、EFGE デジタルフォースゲージを使用して評価しました。組織学的研究は、熱傷誘発直後の 21 日目に直ちに開始されました。

21日目に首を切り落とした後、治癒した自然な皮膚の全厚(1cm2)を慎重に切除しました。組織の重量を量り、1 × PBS 中で 4 °C でガラスホモジナイザーを使用してホモジナイズし (組織重量 (g): PBS (mL) 体積 = 1:9)、続いて 10,000 g、4 °C で 30 分間遠心分離しました。。生化学パラメータには、標準プロトコールに従って、均質化された皮膚サンプルのマロンジアルデヒド (MDA)69、グルタチオン (GSH)70、および (カタラーゼ) CAT71 レベルが含まれます。これらは、UV/可視ダブルビーム分光光度計 (島津製作所) を使用して分析され、ナノモルで表されます。それぞれMDA/ml、μmol/g組織、μmolの利用された過酸化水素/mg/組織/分。

皮膚組織の加水分解物は、2172 日目の前述のプロトコールに従って調製されました。顆粒化組織のヒドロキシプロリン (HXP) およびヘキソサミン (HXA) 含有量は、前述のプロトコールおよび島津製作所の UV/可視ダブルビーム分光光度計を使用して推定されました。組織のμg/mgで表されます。

均質化した皮膚サンプルの核因子カッパ B (NF-κB) を、Rat NF-ŚB ELISA パッケージ (Biolab Technology Laboratory, Shanghai Korian Biotech Co., Ltd) を使用してサンドイッチ ELISA 理論に基づいて測定しました。サンプルはオペレーターのプロトコールに従って調製され、マイクロプレートリーダー (Alere AM 2100) を使用して 10 分以内に 450 nm で測定されました。

各グループのラットは、組織病理学的検査のために創傷後 21 日目に安楽死させられた。緩衝ホルマリン (10%) に入れ、アルコールで脱水した組織サンプル (2 × 3 mm) を切除し、最終的にパラフィンワックスブロックに挿入しました。病理学的変化を評価するために、組織サンプルの薄片 (5 μm) をヘマトキシリンおよびエオシン (H および E) で染色しました 73。染色されたスライドは、Magnus Pro Image Analysis ソフトウェアを使用して、Olympus Life Science Solutions の Olympus CX41 顕微鏡で研究されました。スライドを調査して、うっ血、変性および壊死、血管新生、線維芽細胞の増殖および上皮化、浮腫および白血球浸潤を測定した。すべての統計結果は、二元配置 ANOVA 法とそれに続く Tukey の事後分析を使用して分析され、GraphPad Prism 8.4.3.686 のすべての値について p ≤ 0.05 が有意であるとみなされました。

化学物質の試験に関する「OECD 402」の規制ガイドラインに準拠した、ウィスターアルビノラットにおけるバイオインスピレーションを受けたゼラチンベースの接着性ヒドロゲルの急性皮膚毒性に関する研究プロトコルは、インドのガーズィヤーバードにある産業研究毒性研究所で実施されました。 .: 202112-25; レポート番号: IIRT/TOX/202112/ADT/0112。

第2度熱傷治癒の研究プロトコールは、パンジャブ州アムリトサルのカルサ薬科大学の動物倫理委員会(IAEC)によって承認された。承認番号を参照してください。 IAEC/KCP/2020/008。

Suchithra TV、Benu G、さまざまな表面用の創傷被覆材パッチとしてのゼラチンベースの粘着性ヒドロゲル。 (出願番号: 202041044794、インド政府特許庁、ステータス: 出願済み)。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開記事に含まれています。

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インド、カリカット国立工科大学バイオテクノロジー学部との共同研究に門戸を開いてくれた、インド、アムリトサルのカルサ薬科大学の動物飼育施設に感謝したいと思います。最終段階でのあらゆる支援に対し、ラクナウ、ババサヘブ・ビムラオ・アンベードカル大学のマドゥカール・サクセナ博士に特別に感謝します。また、ヒドロゲルの毒性最適化を許可してくださったアヌギャ・バット博士と彼女のチームにも感謝いたします。

インド、カリカットの国立カリカット工科大学バイオテクノロジー学部

ベヌ・ジョージ & スチトラ TV

カルサ薬科大学薬学部、アムリトサル、パンジャブ、インド

ニティッシュ・バティア & アビヒンダー・クマール

GD ゴエンカ大学、医療および関連科学部、ハリヤナ州、インド

ニティッシュ・バティア

CSIR - 中央皮革研究所、アディヤール、チェンナイ、インド

グナナマニ A.、ティラガム R.、シャヌジャ SK

インド、カリカット大学カリカット大学動物学部生化学および分子生物学部門

Kannan Vadakkadath Meethal & Shiji TM

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BG: 概念化、検証、方法論、調査、形式分析、執筆—原案。 STV: 方法論、検証、監督、執筆 - レビューと編集。 NB および AK: 方法論、リソース、形式分析、編集。 GRT と SKS: リソース、編集。 KVM と STM: 方法論、リソース、編集。

Suchithra TV への対応。

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George, B.、Bhatia, N.、Kumar, A. 他バイオインスパイアされたゼラチンベースの粘着性ハイドロゲルで、熱傷の治療におけるさまざまな表面に使用されます。 Sci Rep 12、13735 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-17054-w

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受信日: 2022 年 4 月 12 日

受理日: 2022 年 7 月 20 日

公開日: 2022 年 8 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17054-w

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